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神長 輝一; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 成田 あゆみ; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
X線マイクロビームを特定の細胞に狙い撃ちした際に、照射細胞及びその周囲の非照射細胞に生じる細胞分裂の様子の変化を、ライブセルイメージングにより追跡した。X線マイクロビームの照射は、高エネルギー加速器研究機構・フォトンファクトリーのBL27Bの顕微照射システムを利用した。従来の顕微照射システムでは、長時間に渡る細胞の継時観察は困難である。そこで照射顕微ステージとは別に、培養器を備えた観察用顕微システムを導入し、照射細胞の位置座標をこの二つの顕微システム間で校正するため特殊なパターンが印字されたポリエチレンフィルムを製作するなど、タイムラプス細胞観察が行える新たな実験システムを工夫した。細胞周期の遅延や分裂後の娘細胞同士の融合が、照射細胞の周囲の非照射細胞(バイスタンダー細胞)にも伝搬するか否かに着目し、20分間隔で48時間にわたり連続して取得した画像データの解析を行った。その結果、マイクロコロニー中の細胞を一つだけ選んで照射しても、周囲の細胞同士の融合現象は観察されなかった。しかし、アポトーシス等の細胞死は、照射細胞だけではなくある頻度でバイスタンダー細胞にも起る可能性が示された。
横谷 明徳; 成田 あゆみ; 神長 輝一; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 野口 実穂; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 藤井 健太郎; 鈴木 啓司*
no journal, ,
放射線照射後の細胞をライブイメージング法により追跡して調べることで、これまで細胞集団の平均値としてしか得られなかった放射線影響を個々の細胞の運命として解析するこが可能になった。このような時間軸に対する一連の細胞のダイナミクス(動的)データは、将来のシステムズバイオロジーへの展開・拡張に必須である。本講演では照射による細胞周期の遅延やミトコンドリアの動態を指標として、KEK-PFにおける軟X線マイクロビーム照射した幾つかのFucci細胞に対するライブイメージングにより得た結果を紹介する。さらに、通常の培養ディッシュの単層培養細胞に比べより生体に近い細胞間相互作用を維持していると期待される3次元培養したHeLa-Fucci細胞のスフェロイドを作製し、これに対してマイクロビームを部分照射することでより生体組織に近い環境におけるバイスタンダー効果の観察も試みている。熱力学的には"非平衡状態"にある相互にフィードバックをかけ合う多数のストレス応答の集合として細胞集団システムを捉え、放射線に対する頑強性(ロバストネス)の予測やこれを支える遺伝子スイッチングのメカニズムについての知見が得られると期待される。
神長 輝一; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 成田 あゆみ; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
放射線の曝露を受けていない細胞(バイスタンダー細胞)が放射線の曝露を受けた細胞からのシグナルを受けることで何らかの影響が発現する現象はバイスタンダー効果と呼ばれ、特に非照射細胞が細胞集団中で多数を占める低線量放射線照射下における影響を考える上で重要なカギとなる。これまでにバイスタンダー細胞に、微小核形成やアポトーシスなどが現れることが知られている。本研究では、バイスタンダー効果が細胞周期に与える影響を明らかにすることを目的とした。コロニー内の任意の細胞に放射光X線マイクロビームを照射した後、全自動タイムラプスイメージングを行える実験系を確立し、細胞分裂を経た細胞にも細胞周期に変異があるかどうかを調べた。その結果、バイスタンダー細胞にも明らかに細胞分裂周期の変異が観測された。非照射細胞が照射細胞からの何らかのシグナルを受け取ることで、自らの細胞周期を制御するための反応経路があることが推定される。
嘉成 由紀子; 神長 輝一; 成田 あゆみ; 宇佐美 徳子*; 鈴木 啓司*; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、細胞内のエネルギー分子(ATP)生産を担うミトコンドリアの活性が、放射線照射によりどのように影響を受けるかを明らかにすることを目的とした。ヒト正常細胞(BJ1-hTERT)に対して、高エネルギー加速器研究機構フォトンファトリーから得られるX線マイクロビームを照射した後に継時観察し、細胞核のみ・細胞質のみに照射した場合を比較した。細胞は、観察の直前にミトコンドリアを特異的に標識するJC-1試薬で染色した。この試薬はミトコンドリアの膜電位が高いと赤色蛍光のドットとして観測され、また低いと緑色蛍光が観測される特徴がある。その結果、細胞核照射群は細胞質照射群よりも細胞あたりのJC-1赤色発光のドット数が、照射後12時間程度まで優位に増加することが明らかになった。核内で損傷したDNAの修復にATPが用いられるために、活性が亢進したと推測される。
坂本 由佳; 横谷 明徳
no journal, ,
低線量影響を解明する上で、バイスタンダー効果は重要な要素である。しかしこれまでの研究では、生体内の環境とは大きく異なる培養ディッシュ上の細胞を試料に用いていた。そのため3次元状態に積層した生体中の細胞間とは、情報伝達のメカニズムとなる可能性がある。本研究では、3次元培養細胞中の細胞間におけるバイスタンダー効果の検証を目標とした。用いた細胞はHeLa細胞であり、低付着性のマルチプレートで培養を行うことでス3次元に細胞が凝集するフェロイド状の細胞塊を作製した。このスフェロイドに対して20
20
mビームサイズのX線マイクロビームをスフェロイド中の特定部位に照射することに成功した。しかし照射後の継時観察中の微妙な温度変化に伴う培地の対流により、スフェロイドが移動してしまう問題点があることがわり、今後の課題として残された。
嘉成 由紀子; 神長 輝一; 坂本 由佳; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 鈴木 啓司*; 横谷 明徳; 藤井 健太郎
no journal, ,
ミトコンドリアは独自のDNAを持ち、生体内エネルギー分子であるATPの生産を担うため、細胞に欠かせない重要な器官である。我々は、細胞の部分照射によるミトコンドリアへの放射線影響を明らかにすることを目的とした。細胞中の特定部位に対する部分照射を行うため、放射光X線マイクロビームを利用した。ヒト線維芽細胞(BJ1 hTERT Fucci)に対し、細胞核照射、細胞質照射及び細胞全体照射の3パターンで照射をし、ミトコンドリアを経時観察した。ミトコンドリアは膜電位に依存して蛍光発色が緑と赤を示すJC-1試薬を用いた。その結果、赤色蛍光で確認される高膜電位のミトコンドリアの面積は、どの照射パターンでも照射直後に大きな値を示し、その後は減少した。細胞核照射では6時間後、細胞質照射では12時間後、細胞全体照射では2時間後まで減少し、その後は増加を示した。細胞質照射後24時間での面積は他の2つの照射パターンと比較し、優位な増加が見られた。以上の結果から、照射部位に依存してミトコンドリアの膜電位の影響が異なる可能性が定性的に示唆された。
坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
バイスタンダー効果によるスフェロイド中の非照射部を含めた動態を明らかにすることを目的とし、HeLa-Fucci細胞で作製したスフェロイドに対するX線マイクロビーム照射と、その後の経時観察を行うための新しい実験系を構築した。照射サンプルであるスフェロイドは、照射用ディッシュに移し、アガロースゲルを含んだ培地で周囲を満たして、動かないよう固定した。マイクロビーム照射には、KEK-PF、BL-27B(生物ステーション)の装置を利用した。ビームサイズは4040mに設定し、直径150mあるスフェロイドの一部分だけを選択的に狙って照射した。照射後は共焦点レーザー顕微鏡を用いて、細胞周期の変化をライブセル観察した。その結果、マイクロビーム照射部の細胞にのみG2アレストがかかり、細胞周期停止や遅延が起こることが確認された。また、マイクロビームを照射していないスフェロイド、マイクロビームを照射したスフェロイドの非照射部のどちらにも、細胞周期の変化は明確には確認されなかったことから、スフェロイドにおけるバイスタンダー効果は小さいと考えられる。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 宇佐美 徳子*; 横谷 明徳
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本研究では、細胞周期を可視化したFucci細胞を試料とし、これに対してX線マイクロビーム照射後、タイムラプスイメージング法で自動観察する実験系を確立した。この実験系では、照射細胞とその周囲の非照射細胞の周期を、個別に追跡することができる。DNA損傷や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常がある場合には、細胞周期に変調(遅延や停止)が生じることが知られているため、細胞周期を追跡することで、細胞内のDNA損傷や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常を検出することができる。HeLa.S細胞をFucci化した細胞に対するマイクロビーム照射の結果、非照射細胞に顕著な細胞周期の変調は観察されなかった。HeLa.S細胞はギャップジャンクションが正常に機能していないことが知られている。今回の結果は、バイスタンダー効果によるDNA損傷の誘発や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常には、ギャップジャンクションが大きな役割を果たしていることを示唆している。
神長 輝一; 篠田 航平; 福岡 壮太郎; 中上 裕貴; 横谷 明徳
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Fucci化されたHeLa細胞を試料として用い、X線照射による細胞周期遅延をライブセル観察により調べた。KEK放射光施設(PF)のBL27Bから得られるX線マイクロビームを利用し、顕微鏡下で細胞に照射した。本顕微照射システムでは、長時間に渡る細胞の継時観察が困難である。このため照射後細胞をビームラインから外し、培養器を備えた別の顕微鏡システムにセットした。オンラインとオフラインの二つの顕微システムにおいて照射細胞の位置座標を共有するため、新たに位置調整用フィルムアタッチメントを製作した。数十個のHeLa-Fucci細胞からなるマイクロコロニー中心部に6060mのX線マイクロビームを照射し、72時間タイムラプス観察を行った。その結果、照射細胞に細胞周期遅延や細胞死、細胞融合などの影響が観察されたことに加え、非照射細胞にも細胞周期遅延が線量や細胞周期に依存して起こることを見出した。これは、新しいタイプのバイスタンダー効果であると考えられる。
横谷 明徳; 神長 輝一; 服部 佑哉; 渡辺 立子; 野口 実穂; 藤井 健太郎
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発がんのプロセスの解明には、放射線照射後に細胞分裂能を失うことなく生存し続ける細胞に現れる変化を、詳細に観察することが重要であると考えられる。そこで、細胞周期により異なる蛍光を発するようFucci化したヒトガン細胞(HeLa-Fucci)に対して、顕微鏡下で特定の細胞を選択した上でX線マイクロビームを照射した。その後72時間ライブセル観察を行った結果、照射細胞の周期がG2期で遅延することが明らかになった。さらに、照射細胞周囲の非照射細胞にも周期遅延が観測され、細胞周期制御にもバイスタンダー効果が現れることを初めて明らかにした。一方、コンピュータを用いて、異なる細胞密度を持つ細胞集団に対する放射線を照射した場合の細胞周期の挙動変化をシミュレートした。その結果、細胞密度が密な細胞集団では、照射により細胞周期が一時停止する細胞数が多くなる結果を得た。これは、培養液中に放出されたシグナル以外にも細胞間のギャップ結合を経由したシグナルの伝達が起こり、バイスタンダー効果が増加することを示している。
神長 輝一; 宇佐美 徳子*; 野口 実穂; 横谷 明徳
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X線マイクロビームを利用し、照射したヒト細胞の周囲の未照射細胞にもバイスタンダー効果により細胞周期ダイナミクスの変化が起こるのか検証を行った。細胞周期を可視化(Fucci化)したHeLa細胞のコロニー(10-20細胞)の中心に、6060mのX線マイクロビーム(0, 10, 20Gy)を照射し、その後72時間のタイムラプスイメージングを行った。得られた画像から、コロニー中の個々の細胞の細胞周期ダイナミクスを系譜図として得た。未照射試料では観察されなかった細胞死が、照射細胞を含むコロニーの未照射細胞にも誘発されたことから、バイスタンダー効果が生じたことが確認された。一方、細胞周期ダイナミクスの変化は、20Gy照射したひとつのコロニーにおいてのみ分裂回数の有意な減少として確認された。これは、バイスタンダー効果により非照射細胞中にもDNAの二本鎖切断が誘発されたため、チェックポイント機構により細胞周期遅延が生じたことによると推測された。